研究背景

水番茄作为一种模式植物，在植物生物学研究领域占有重要地位(曹慧颖等, 2012)。单倍体诱导技术作为现代高效育种体系的主要组成部分一直是番茄遗传育种领域的研究热点，通过组织培养技术来扩大物种的遗传基础也已成为新种质资源形成的重要手段(张志仙等, 2015)。

在离体培养条件下,花粉改变其正常发育进程转向产生愈伤组织和植株,为研究高等植物的突变和细胞遗传开辟了新的途径(Carlson, 1970; Nillson and Wettstein, 1970)。育种上用花药培养产生单倍体，单倍体再进行染色体加倍获得双单倍体可克服杂种性状的分离。花粉和花药培养与常规多代自交系杂交相比具有快速获得纯系，效率高、周期短且纯系稳定等特点(申娟等, 2008)。研究发现对接种的花药进行预处理，可有效提高花粉愈伤组织的诱导率。对花药进行预处理的研究目前主要集中在高温、低温及离心等因素上，而对甘露醇预处理加工番茄花药的研究较少。在国内的研究报道中，发现用甘露醇预处理马铃薯、大麦等花药，进行离体培养在一定范围内可以增加愈伤组织诱导率。

目前通过花药组织培养技术进行单倍体育种仍未能广泛应用于各种农作物育种中，在番茄上虽然有花药培养获得单倍体以及双单倍体植株的报道，但研究表明在栽培番茄的重要基因型中花药培养技术并不能普遍应用。为了提高番茄花药培养愈伤组织诱导率，前人主要从培养基类型、激素种类、基因型等方面进行了研究，而采用甘露醇对花药进行预处理的报道较少。本研究通过对加工番茄花药进行不同浓度、不同时间甘露醇的预处理，探讨甘露醇预处理对加工番茄花药愈伤组织诱导率的影响，旨在优化加工番茄花药培养体系，提高培养效率，以期为加工番茄花药培养提供理论依据。

1结果与分析

甘露醇预处理对加工番茄花药愈伤组织诱导具有显著影响，不同基因型之间经甘露醇预处理后，其花药愈伤组织诱导率也有差异。当甘露醇浓度超过0.6 mol/L，无论处理多少天，加工番茄花药的愈伤组织诱导率均为0(表1~表6)。

1.1甘露醇预处理对杂交组合1愈伤组织诱导的影响

所有处理中只有甘露醇浓度在0.4 mol/L、预处理时间在4 d时，杂交组合1的花药愈伤组织诱导率达到最大值92.33% (表1)，极显著高于对照，其他处理的愈伤组织诱导率均极显著低于对照，且随着甘露醇处理浓度及处理时间的增加，甚至无法形成愈伤组织，如0.6 mol/L甘露醇预处理时间达到6 d以上时愈伤组织诱导率为0，浓度为0.8 mol/L时，无论处理几天，均没有愈伤组织形成。

表1 甘露醇预处理对杂交组合1愈伤组织诱导(%) 注: 数字后小写和大写字母分别表示在5%和1%水平上的差异显著性 Table 1 The callus induction rate of mannitol on of “Genotype 1” (%) Note: The capital and lowercase letlers after digital denote respectively 5% and 1% level of difference significance

1.2甘露醇预处理对杂交组合2愈伤组织诱导的影响

甘露醇预处理对杂交组合2愈伤组织诱导率的影响与杂交组合1有相同趋势(表2)。即甘露醇浓度在0.4 mol/L时，预处理时间为4 d时，杂交组合2的花药愈伤组织诱导率极显著高于对照，达到最大值94.67%，其他处理的愈伤组织诱导率均极显著低于对照，且随着甘露醇处理浓度及处理时间的增加，甚至无法形成愈伤组织。

表2 甘露醇预处理对杂交组合2愈伤组织诱导(%) 注: 数字后小写和大写字母分别表示在5%和1%水平上的差异显著性 Table 1 The callus induction rate of mannitol on of “Genotype 2” (%) Note: The capital and lowercase letlers after digital denote respectively 5% and 1% level of difference significance

1.3甘露醇预处理对杂交组合3愈伤组织诱导的影响

杂交组合3对甘露醇预处理比较敏感(表3)，当甘露醇浓度为0.2 mol/L、0.4 mol/L时，预处理时间4 d时，花药愈伤组织诱导率均达到100.00%，甘露醇浓度为0.2 mol/L预处理6 d时花药愈伤组织诱导率也极显著高于对照。当甘露醇浓度为0.4 mol/L时，预处理时间2 d时，杂交组合3的花药愈伤组织诱导率与对照相同，其他处理的均极显著低于对照。当浓度超过0.8 mol/L时，无论处理几天，均没有愈伤组织形成。因此杂交组合3采用0.2 mol/L甘露醇预处理4 d是提高花药愈伤组织诱导率较为合适条件。

表3 甘露醇预处理对杂交组合3愈伤组织诱导(%) 注: 数字后小写和大写字母分别表示在5%和1%水平上的差异显著性 Table 1 The callus induction rate of mannitol on of “Genotype 3” (%) Note: The capital and lowercase letlers after digital denote respectively 5% and 1% level of difference significance

1.4甘露醇预处理对杂交组合4愈伤组织诱导的影响

对于杂交组合4，用0.4 mol/L甘露醇预处理加工番茄花药进行愈伤组织诱导具有较好的效果(表4)。预处理时间为2 d、4 d时，杂交组合4的愈伤组织诱导率高于对照且差异极显著，预处理1 d时虽愈伤组织诱导率大于对照，但没有显著差异。其他处理的愈伤组织诱导率均极显著低于对照，且随着甘露醇处理浓度及处理时间的增加，甚至无法形成愈伤组织，0.6 mol/L甘露醇预处理时间达到6 d以上时愈伤组织诱导率为0，浓度为0.8 mol/L时，没有愈伤组织形成。

表4 甘露醇预处理对杂交组合4愈伤组织诱导(%) 注: 数字后小写和大写字母分别表示在5%和1%水平上的差异显著性 Table 1 The callus induction rate of mannitol on of “Genotype 4” (%) Note: The capital and lowercase letlers after digital denote respectively 5% and 1% level of difference significance

1.5甘露醇预处理对杂交组合5愈伤组织诱导的影响

甘露醇浓度0.2 mol/L预处理4 d，杂交组合5的花药愈伤组织诱导率达到81.00% (表5)，极显著高于对照；甘露醇浓度为0.4 mol/L、预处理1 d时，花药愈伤组织诱导率达到最大值83.33%，与对照差异极显著，预处理时间在2 d时愈伤组织诱导率与对照相比没有显著差异。其他处理的愈伤组织诱导率均极显著低于对照，同样高浓度的甘露醇预处理后杂交组合5的花药愈伤组织诱导率为0。

表5 甘露醇预处理对杂交组合5愈伤组织诱导(%) 注: 数字后小写和大写字母分别表示在5%和1%水平上的差异显著性 Table 1 The callus induction rate of mannitol on of “Genotype 5” (%) Note: The capital and lowercase letlers after digital denote respectively 5% and 1% level of difference significance

1.6甘露醇预处理对杂交组合6愈伤组织诱导的影响

杂交组合6的花药不经过甘露醇预处理(表6)，愈伤组织诱导率较低，只有16.56%，有10个处理的愈伤诱导率都极显著高于对照，其中浓度为0.2 mol/L预处理4 d，愈伤组织诱导率达到了100.00%，浓度为0.4 mol/L预处理2 d愈伤诱导率达到95.33%，两处理间差异不显著。因此0.2 mol/L甘露醇预处理4 d可以作为杂交组合6预处理的最佳浓度和时间。

表6 甘露醇预处理对杂交组合6愈伤组织诱导(%) 注: 数字后小写和大写字母分别表示在5%和1%水平上的差异显著性 Table 1 The callus induction rate of mannitol on of “Genotype 6” (%) Note: The capital and lowercase letlers after digital denote respectively 5% and 1% level of difference significance

2讨论

对接种花药进行预处理，是在生理生化方面改变细胞生理状态，形态方面改变小孢子极性分布以及分裂方式和发育途径，以提高花药的诱导率，通常采用的方式是高温预处理、低温预处理、预培养和离心预处理等(蒋青青, 2012)。有人在低温环境下对培养前的小孢子进行了甘露醇预处理，将含有单核期小孢子的花药在含甘露醇的培养基上进行培养，发现小孢子可进行正常生长，并在培养30 d后得到多核细胞(Bal等, 2005)。有研究也发现随着甘露醇浓度的增加，诱导产生的愈伤组织呈现先增后减的趋势(蒋青青, 2012)。本试验也通过甘露醇预处理加工番茄花药，得到较高的愈伤组织诱导率，发现当浓度为0.2~0.4 mol/L时，不同基因型加工番茄的花药愈伤组织诱导率增有上升趋势，而0.6~0.8 mol/L时愈伤组织诱导率呈下将趋势，这与前人研究结果基本一致。

有人利用甘露醇预处理对花楸体细胞胚进行诱导，发现未成熟的合子胚经1 mol/L甘露醇预处理24 h后,接种在添加0.5 mg/L 6-BA (6-苄氨基腺嘌呤, 6-Benzylaminopurine)、0.2 mg/L 2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid)和4%蔗糖的MS(Murashige and Skoog medium)培养基上培养可产生大量体胚,体胚诱导率可达84%，显著高于未经甘露醇预处理的(诱导率为38%) (沈海龙等, 2008)。本研究通过研究甘露醇预处理加工番茄花药，发现用浓度为0.2 mol/L或0.4 mol/L的甘露醇培养基预处理4 d时，大部分参试组合的花药愈伤组织诱导率极显著高于对照，与其结果一致。当甘露醇浓度达到0.6 mol/L时，加工番茄花药愈伤组织诱导率明显降低，甘露醇浓度达到0.8 mol/L时，加工番茄花药愈伤组织诱导率为0，在马铃薯花药离体培养研究中，甘露醇预处理对愈伤诱导率的影响也表现为随着处理浓度及天数增加，愈伤组织诱导率先上升后下降(姜丽静等, 2014)。

试验表明，甘露醇预处理加工番茄花药浓度较为适宜时，花药愈伤组织诱导率最高可达100.00%，如0.2 mol/L、0.4 mol/L甘露醇预处理4 d时杂交组合20040805×P1花药愈伤组织诱导率均能达到100.00%；综合来看，0.2~0.4 mol/L甘露醇预处理加工番茄花药4d时对大多数基因型愈伤组织诱导率都有极显著的提高作用。这与禾谷类作物饥饿协迫一般采用适当浓度甘露醇处理，25℃温度条件下大麦花药在0.3~1.5 mol/L甘露醇溶液下处理3~4 d，大麦小孢子培养胚胎发生和植株再生显著增加，甘露醇浓度在0.3~0.7 mol/L之间时高温加饥饿预处理能诱导小麦胚胎发生的结果一致(赵爱菊等, 2008)。

不同材料的花药经过甘露醇预处理，对花药愈伤组织的诱导效果因基因型不同而有所差异(武晓红等, 2015)。这可能是因为不同作物的基因型不同，对甘露醇预处理的效果也有所不同，本研究也发现，经甘露醇预处理后杂交组合20040805×P1、P1×P2的花药愈伤组织诱导率可以达到100.00%；组合P2×20040805、P3×P2、20040805×P3也在90%以上，P1×P3的花药愈伤组织诱导率(83.33%)虽没有其他组合高但也极显著的高于对照，这与武晓红等人研究结果一致：即甘露醇预处理因不同基因型而效果不同。

3材料与方法

3.1试验材料

试验所用材料为P2×20040805 (组合1)、P3×P2 (组合2)、20040805×P1 (组合3)、20040805×P3 (组合4)、P1×P3 (组合5)、P1×P2 (组合6) 6个杂交组合，由石河子大学加工番茄育种课题组提供。试验材料于2014年9月种植在石河子大学农学院试验站温室,12月采集加工番茄花药进行试验。室内试验于2014-2015年在石河子大学农学院组织培养室、温室和“新疆特色果蔬生产”重点实验室完成。

3.2试验方法

选择小孢子发育时期为单核靠边期的花蕾，采集后的花蕾用自来水冲洗5~6遍，70％的酒精灭菌30 s，15％NaOCl加两滴吐温消毒10 min(白玉娥等, 2015)，将加工番茄花药接种在不同浓度甘露醇培养基上，处理时间分别为1 d、2 d、4 d、6 d、8 d。预处理培养基为MS+0.5mg/LNAA(naphthalene acetic acid, 萘乙酸)+1 mg/L6-BA (6-苄基嘌呤, 6-Benzylaminopurine)+40 g/L蔗糖+甘露醇，甘露醇浓度设为0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L。预处理结束后接种在基本培养基MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+40 g/L蔗糖上继续培养，以没有经过甘露醇预处理作为对照。pH值5.8 (张丽杰等, 2015)，接种密度为每50 mL的三角瓶6个花药，每处理接6瓶。培养温度(25±1)℃，黑暗培养7 d后转至光照培养箱中继续培养，培养温度为(28±1)℃，光强2 000 Lx，光照时间为16 h/d。25 d后记录愈伤组织数，统计分析不同处理加工番茄花药愈伤组织诱导率。

3.3结果观测与数据处理

愈伤率(%)=产生愈伤组织数花药数/接种花药数×100%

加工番茄愈伤诱导率用F检验进行差异显著性分析，多重比较使用新复极差法，显著水平取0.05和0.01。

作者贡献

闫丽娟是本研究的实验设计和实验研究的执行人；闫丽娟完成数据分析，试验结果分析，论文初稿的写作；马海新、汪斌和樊新民参与实验的执行；庞胜群是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由科技支疆计划项目(2014AB004)和石河子大学课题(gxjs2012-yz08)共同资助。

参考文献

Bai Y.E., Cao C., Peng P., Dai J.L., He Y.H., and Cao H., 2015, Factors influencing the initiation of embryogenic callus in Picea mongolica, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 13(6): 1363-1368 (白玉娥, 曾超, 彭鹏, 代金玲, 何炎红, 曹欢, 2015, 沙地云杉胚性愈伤组织诱导, 分子植物育种, 13(6): 1363-1368)
 

Cao H.Y., Zhang L.J., Xia R.X., Gao S., Wang S., and Zhang S.B., 2012, Research progress on tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) tissue culture, Zhongguo Shucai (China Vegetables), (16): 10-14 (曹慧颖, 张立军, 夏润玺, 高嵩, 王思, 张少斌, 2012, 番茄组织培养研究进展, 中国蔬菜,(16): 10-14)
 

Carlson P.S., 1970, Induction and isolation of auxotrophic mutants in somatic cell cultures of nicotiana tabacum, Science, 168(3930), 487-489
http://dx.doi.org/10.1126/science.168.3930.487
PMid:17838129
 

Jiang Q.Q., 2012, Constrcution of tomato anther culture system, Thesis for M.S., Shanghai Jiao Tong University ，Supervisor: Chen H.Y., Liu.Y., pp. 8-10 (蒋青青, 2012, 番茄花药培养体系的优化, 硕士学位论文, 上海交通大学, 导师:陈火英, 刘杨, pp.8-10)
 

Nillson T.T., and Wettstein K.D., 1970, Plent Cells Killed by Soft Rot, Nature, 227(19), 1265-1266
 

Shen H.L., Gao X.X., and Yang L., 2008, Effects of mannitol, sucrose and cold pretreatment on somatic embryogen-esis of sorbus pohuashanensis (Hance) hedl, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Communications), 44(4): 667-681 (沈海龙, 高翔翔, 杨玲, 2008, 甘露醇、蔗糖和低温预处理对花楸体细胞胚诱导的影响, 植物生理学通讯, 44(4): 667-681)
 

Shen J., Cao G.Q., Liang Q.X., Ying F.Q., and Ding X.B., 2008, Identification of cytological development period and activity of tomato's microspore, Changjiang Shucai (Journal of Changjiang Vegetables), 10(08): 21-24 (申娟, 曹刚强, 梁秋霞, 应芳卿, 丁晓兵, 2008, 番茄小孢子发育时期的检测和活性鉴定, 长江蔬菜, 10(08): 21-24)
 

Bal U., and Abak K., 2005, Induction of symmetrical nucleus division and multicellular structures from the isolated microspores of Lycopersicon esculentum Mill, Biotechnol. Eq, 19(1): 35-42.
http://dx.doi.org/10.1080/13102818.2005.10817151
 

Wu X.H., Liu M.J., and Zhao X.P.,2015, Influence of mannitol pretreatment on the induction of anther callus in ziziphus jujube, He'nan Nongye Kexue (Journal of Henan Agricultural Sciences), 19(4): 56-58, 66 (武晓红, 刘孟军, 赵习平, 2015, 甘露醇预处理对枣花药愈伤组织诱导的影响, 河南农业科学, 19(4): 56-58, 66)
 

Zhang Li-jie, Zhao Li-meng, Lu Xiu-jun, and Shen Hai-long, 2015, Callus induction and somatic embryogenesis from zygotic cotyledons and hypocotyls of fraxinus mandshurica rupr, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 13(7): 1645-1652 (张丽杰, 赵丽蒙, 陆秀君, 沈海龙, 2015, 水曲柳子叶和下胚轴愈伤组织和体胚的诱导, 分子植物育种, 13(7): 1645-1652)
 

Zhang Z.X., Zhu C.Z., Tan G.Y., Wang F., and He D.G., 2015, Application of tissue culture, molecular marker and QTL analysis in Broccoli breeding, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 13(4): 919-928 (张志仙, 朱长志, 檀国印, 王峰, 何道根, 2015, 组织培养、分子标记和QTL技术在青花菜育种中的应用, 分子植物育种, 13(4): 919-928)
 

Zhao A.J., Gao Z.Y., Li Y.J., Liu Y.P., and Chen X.Y., 2008, Study on the methods of cereal crops microspore culture, Hebei Nongye Kexue (Journal of Hebei Agricultural Sciences), 12(4): 73-74, 80 (赵爱菊, 高增玉, 李亚军, 刘玉平, 陈希勇, 2008, 禾谷类作物的小孢子培养, 河北农业科学, 12(4): 73-74,80)